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NABP2：肝细胞癌表达的潜在生物标志物及其与临床病理与免疫浸润的关联
文章字数：1773
摘要：本研究通过qPCR分析发现，与正常肝细胞LO2相比，肝细胞癌（HCC）细胞中NABP2的表达水平显著升高。进一步的数据库分析证实，NABP2蛋白在HCC中的表达上调，并与HCC患者的临床病理特征密切相关。此外，NABP2的表达还与多个免疫细胞标志物（包括STAT6、STAT5A、STAT4、LAG3、CTLA4、CD8A、CD8B和KIR2DL4）呈现相关性。综合这些发现，我们揭示了NABP2与HCC预后及免疫浸润的潜在联系，暗示NABP2可作为HCC诊断和预后的潜在生物标志物。本研究为深入理解HCC的分子机制及开发新的诊疗策略提供了重要的科学依据。
关键词：肝细胞癌；免疫浸润；NABP2
一、引言
肝细胞癌（HCC）是肝脏常见恶性肿瘤，发病率高、预后差，3年生存率低，中位生存时间短。手术切除加化疗虽是早期HCC有效治疗策略，但易转移致手术复杂风险高。近年研究显示免疫浸润对HCC治疗及预后影响大，需探索新免疫相关治疗靶点。单链DNA结合蛋白在细胞代谢中关键，新发现的NABP2对维持基因组稳定重要。不过，NABP2在HCC中的表达及作用不明，本研究分析了相关数据库，揭示了其对HCC预后的影响及与免疫微环境的潜在联系。
二、材料与方法
（一）细胞培养和qPCR分析
LO2、HUH7、Hepg2、LM3、97L和Hep2.215细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，37℃，5% CO2。
（二）NABP2mRNA和蛋白水平的变化
从以上细胞中提取总RNA，然后使用qPCR检测HCC细胞中NAPB2的mRNA水平。与此同时，利用人蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org）中的IHC分析NABP2蛋白在HCC中的表达水平。利用临床蛋白质组学肿瘤分析协会（CPTAC）蛋白质组学数据库（https://cptac-data-portal.georgetown.edu/cptacPublic）中的NABP2蛋白水平。
（三）TCGA和ICGC数据库分析
我们利用TCGA和ICGC数据库评估NABP2mRNA表达与HCC患者临床病理特征的相关性。
（四）NABP2表达与免疫细胞的相关性
利用TIMER和基因表达谱交互分析（GE-PIA）数据库分析NABP2与免疫标记基因表达的相关性。
（五）统计分析
数据来自TCGA，均按R-3.6.1确定。采用limma和vioplot包分析NABP2在TCGA、ICGC和CPTAC组中的不同表达水平。采用Kaplan-Meier绘图仪对ICGC样本进行生存分析。通过Spearman相关分析，在GEPIA数据库和TIMER中评估NABP2基因表达的相关性。
三、结果
（一）NABP2mRN和蛋白水平的表达
采用qPCR技术检测NABP2在LO2正常肝细胞株及HUH7、HepG2、LM3、97L和Hep2.215等多种HCC细胞株中的mRNA表达水平。对比LO2细胞发现，97L和Hep2.215细胞株中NABP2的mRNA表达显著上调。为进一步验证，利用HPA数据库分析其蛋白表达水平，并通过免疫组化技术观察到，NABP2蛋白在HCC组织中的表达显著高于正常肝细胞，与mRNA水平检测结果一致。这些数据表明，NABP2在HCC细胞中的表达显著高于正常肝细胞。
（二）人肝组织中NABP2的高表达
为进一步探究NABP2在人体各组织中的表达特征，我们利用GTEx数据库分析。在该数据库中，红色代表高表达水平，而黑色则代表低表达水平。结果显示，NABP2 mRNA在大多数正常组织中均呈现高表达状态。然而，值得注意的是，在肝脏组织中，NABP2的表达水平相对较低，且在不同性别（女性和男性）的肝脏组织中并未观察到显著差异。
（三）NABP2表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性研究
接下来，我们利用TCGA和ICGC数据库评估NABP2mRNA表达与HCC患者临床病理特征的相关性。我们发现NABP2高表达与高分期、高存活、高组织学相关_在TCGA数据库中，grade和White (p=0.004, p=0.004, p=7.699e-06和p=0.007）。与这些结果一致，在ICGC数据库中，高NABP2与存活、高恶性和分期（p=7.349e-04,7.524e-04和0.007）相关。
（四）NABP2与免疫特征的相关性
我们利用TCGA数据库对NABP2表达水平与浸润免疫细胞的相关性进行了初步分析。随后，为验证这一发现，我们采用R软件在GE-PIA数据库中进行了进一步验证。NABP2在HCC中的表达水平与多种免疫细胞标记基因的表达显著相关，包括Th2（STAT6、STAT5A）、Th1（STAT4）、T细胞（general）（CD2）、T细胞衰竭（CTLA4和LAG3）、CD8+ T细胞（CD8B和CD8A）、自然杀伤细胞（KIR2DL4）等标记基因的表达显著相关，提示NABP2与HCC中免疫细胞的浸润有关。
四、讨论
HCC高死亡率，其发病率和相关死亡给全球健康带来沉重负担。研究表明免疫浸润影响HCC患者预后和治疗，需发现新免疫相关治疗靶点。本研究首次报道NABP2在HCC患者中的表达、与临床病理特征的相关性及与免疫浸润的潜在关系。研究发现，NABP2在HCC中过表达，且与患者临床病理特征相关，高表达NABP2或成潜在预后指标。其表达水平还与Th细胞标记基因相关，是肿瘤免疫状态潜在生物标志物，可预测免疫治疗效果。不过，还需大规模转录组和蛋白质组研究及功能研究。
基金项目：2023年度湖南省教育厅重点研发项目“NABP2诱导巨噬细胞M2极化促进肝癌进展的机制研究”（23A0727）；2024年湖南省自然科学区域联合基金项目“NABP2诱导Th2免疫细胞极化及重塑肿瘤微 环境促进肝癌进展的研究”（2024JJ7337）。
作者单位：1.湖南医药学院医学检验学院；2.湖南医药学院药学院；作者卢星军系本文通讯作者
关键词：肝细胞癌；免疫浸润；NABP2
一、引言
肝细胞癌（HCC）是肝脏常见恶性肿瘤，发病率高、预后差，3年生存率低，中位生存时间短。手术切除加化疗虽是早期HCC有效治疗策略，但易转移致手术复杂风险高。近年研究显示免疫浸润对HCC治疗及预后影响大，需探索新免疫相关治疗靶点。单链DNA结合蛋白在细胞代谢中关键，新发现的NABP2对维持基因组稳定重要。不过，NABP2在HCC中的表达及作用不明，本研究分析了相关数据库，揭示了其对HCC预后的影响及与免疫微环境的潜在联系。
二、材料与方法
（一）细胞培养和qPCR分析
LO2、HUH7、Hepg2、LM3、97L和Hep2.215细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，37℃，5% CO2。
（二）NABP2mRNA和蛋白水平的变化
从以上细胞中提取总RNA，然后使用qPCR检测HCC细胞中NAPB2的mRNA水平。与此同时，利用人蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org）中的IHC分析NABP2蛋白在HCC中的表达水平。利用临床蛋白质组学肿瘤分析协会（CPTAC）蛋白质组学数据库（https://cptac-data-portal.georgetown.edu/cptacPublic）中的NABP2蛋白水平。
（三）TCGA和ICGC数据库分析
我们利用TCGA和ICGC数据库评估NABP2mRNA表达与HCC患者临床病理特征的相关性。
（四）NABP2表达与免疫细胞的相关性
利用TIMER和基因表达谱交互分析（GE-PIA）数据库分析NABP2与免疫标记基因表达的相关性。
（五）统计分析
数据来自TCGA，均按R-3.6.1确定。采用limma和vioplot包分析NABP2在TCGA、ICGC和CPTAC组中的不同表达水平。采用Kaplan-Meier绘图仪对ICGC样本进行生存分析。通过Spearman相关分析，在GEPIA数据库和TIMER中评估NABP2基因表达的相关性。
三、结果
（一）NABP2mRN和蛋白水平的表达
采用qPCR技术检测NABP2在LO2正常肝细胞株及HUH7、HepG2、LM3、97L和Hep2.215等多种HCC细胞株中的mRNA表达水平。对比LO2细胞发现，97L和Hep2.215细胞株中NABP2的mRNA表达显著上调。为进一步验证，利用HPA数据库分析其蛋白表达水平，并通过免疫组化技术观察到，NABP2蛋白在HCC组织中的表达显著高于正常肝细胞，与mRNA水平检测结果一致。这些数据表明，NABP2在HCC细胞中的表达显著高于正常肝细胞。
（二）人肝组织中NABP2的高表达
为进一步探究NABP2在人体各组织中的表达特征，我们利用GTEx数据库分析。在该数据库中，红色代表高表达水平，而黑色则代表低表达水平。结果显示，NABP2 mRNA在大多数正常组织中均呈现高表达状态。然而，值得注意的是，在肝脏组织中，NABP2的表达水平相对较低，且在不同性别（女性和男性）的肝脏组织中并未观察到显著差异。
（三）NABP2表达水平与HCC患者临床病理特征的相关性研究
接下来，我们利用TCGA和ICGC数据库评估NABP2mRNA表达与HCC患者临床病理特征的相关性。我们发现NABP2高表达与高分期、高存活、高组织学相关_在TCGA数据库中，grade和White (p=0.004, p=0.004, p=7.699e-06和p=0.007）。与这些结果一致，在ICGC数据库中，高NABP2与存活、高恶性和分期（p=7.349e-04,7.524e-04和0.007）相关。
（四）NABP2与免疫特征的相关性
我们利用TCGA数据库对NABP2表达水平与浸润免疫细胞的相关性进行了初步分析。随后，为验证这一发现，我们采用R软件在GE-PIA数据库中进行了进一步验证。NABP2在HCC中的表达水平与多种免疫细胞标记基因的表达显著相关，包括Th2（STAT6、STAT5A）、Th1（STAT4）、T细胞（general）（CD2）、T细胞衰竭（CTLA4和LAG3）、CD8+ T细胞（CD8B和CD8A）、自然杀伤细胞（KIR2DL4）等标记基因的表达显著相关，提示NABP2与HCC中免疫细胞的浸润有关。
四、讨论
HCC高死亡率，其发病率和相关死亡给全球健康带来沉重负担。研究表明免疫浸润影响HCC患者预后和治疗，需发现新免疫相关治疗靶点。本研究首次报道NABP2在HCC患者中的表达、与临床病理特征的相关性及与免疫浸润的潜在关系。研究发现，NABP2在HCC中过表达，且与患者临床病理特征相关，高表达NABP2或成潜在预后指标。其表达水平还与Th细胞标记基因相关，是肿瘤免疫状态潜在生物标志物，可预测免疫治疗效果。不过，还需大规模转录组和蛋白质组研究及功能研究。
基金项目：2023年度湖南省教育厅重点研发项目“NABP2诱导巨噬细胞M2极化促进肝癌进展的机制研究”（23A0727）；2024年湖南省自然科学区域联合基金项目“NABP2诱导Th2免疫细胞极化及重塑肿瘤微 环境促进肝癌进展的研究”（2024JJ7337）。
作者单位：1.湖南医药学院医学检验学院；2.湖南医药学院药学院；作者卢星军系本文通讯作者